具有两个或多个肽键的化合物会发生缩二脲反应。在碱性溶液中，缩二脲与铜离子结合形成复杂的紫红色络合物。蛋白质和多肽的肽键与缩二脲结构相似，也能与铜离子形成紫红色配位化合物，在540nm处有最大光吸收。颜色深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质相对分子质量和氨基酸组成无关。该方法测定蛋白质的浓度范围适宜为1~10mg/mL。缩二脲法常用于蛋白质的快速测定。
①双缩脲法：A540-蛋白浓度标准曲线
②紫外吸收法：A280-蛋白浓度标准曲线
实验操作：
取缩二脲试剂、10mg/mL标准蛋白溶液和待测蛋白溶液（人血清稀释10倍），按下表配制6份溶液：
紫外线吸收测量
用途要求：
了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
掌握紫外分光光度计的使用。
实验原理：蛋白质分子中含有的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，导致蛋白质在波长280nm处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的吸光值（A280）与其含量成正比，可用于定量测定。紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是快速、简便、不消耗样品、低浓度盐不干扰测定。所以。它广泛用于检测柱色谱分离中的蛋白质洗脱。该方法的缺点是：①测量与标准蛋白中酪氨酸、色氨酸含量显着差异的蛋白存在一定误差； ② 如果样品中存在核酸等吸收紫外线的物质，则会产生较大的干扰。 。不同的蛋白质和核酸有不同的紫外吸收，即使经过校正，测量结果仍然存在一定的误差。但可以作为初步的定量依据。该方法的可测量蛋白质范围应为0.1至1.0 mg/mL。
试剂及仪器： 1、标准及待测蛋白质溶液 （1）标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白，预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，并配制成1mg /mL 蛋白质溶液根据其纯度。 (2)待测蛋白溶液：人血清，使用前稀释100倍。 2. 设备
试管1.5cmx15cm（x9）；试管架；移液管 1mL (x3)、2mL (x2)、5mL (x2)；分光光度计。
操作方法： 1.制作标准曲线
取8个试管号，按表将各种试剂加入每个试管中，摇匀。使用光程为1cm的石英比色皿，在280nm波长下测定各溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。
注：
由于不同的蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，因此颜色的深浅往往会随蛋白质的不同而变化。因此，该测定通常仅适用于确定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外，蛋白质溶液中核酸或核苷酸的存在也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。
3。标准曲线绘制及蛋白浓度计算
曲线如上面①、②所示。
双缩脲法：配制溶液（0.5mL十倍稀释血清稀释至1mL）蛋白浓度为4.27mg/mL。 10倍稀释血清中蛋白浓度为4.27*2mg/mL。原血清中蛋白浓度为4.27*2*10=85.4mg/mL。
紫外吸收法：配制溶液（1mL血清稀释100倍稀释至4mL）的蛋白浓度为0.377mg/mL。稀释100倍的血清中蛋白浓度为0.377*4mg/mL。原血清中蛋白浓度为0.377*4*100=150.8mg/mL。
4。结果分析与讨论
缩二脲法测得血清中蛋白浓度为85.4mg/mL，紫外分光光度法测得血清中蛋白浓度为150.8mg/mL。结果相差较大，讨论如下：
缩二脲法的原理是铜离子与蛋白质形成有色络合物显色，受非蛋白质物质影响较小，结果接近人血清中蛋白质浓度60的正常范围-80 mg/mL，结果更可靠；然而，测量人体血清的紫外吸收测量方法远远超出正常范围，且准确度很低。查阅相关文献后发现，当样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸吸收紫外光物质时，在280 nm处测定蛋白质含量时，会出现较大的干扰，即吸光度增大，使得测量的蛋白质浓度过高，而人血清样本中含有较多的核酸物质。如果符合这个描述，就可以认为是人类遗传物质造成的干扰。再次查阅文献得知，为了减少核酸物质对蛋白质浓度测量的干扰，需要利用核酸在260 nm处比280 nm处的光吸收更强，而蛋白质则具有相反的特性，使用 280 nm 和 260 nm。以nm为单位的吸光度差用于计算蛋白质含量，并相应地形成校正表。具体计算应根据修正表进行计算。
5。思考问题
有哪些因素会干扰缩二脲法测定蛋白质浓度？ ①样品中含有的脂质和色素干扰比色。 ②不同碱性条件下蛋白质浓度的线性相关性不同。 ③硫酸铵、EDTA、某些氨基酸等干扰铜离子的反应。
（2）用紫外吸收法测定蛋白质含量时，如果样品中含有核酸杂质，实验结果应如何校正？ ① 使用离子色谱柱进一步纯化样品，降低样品中核酸物质的含量。 ②可以采用查校准表再计算的方法，并进行适当的修正，以减少核酸的干扰。但由于不同蛋白质和核酸的紫外吸收不同，即使经过校正，测量结果仍会存在一定的误差。 。